设计:随机对照动物实验。
时间及地点:实验于2010年5至12月在河南省精神病院中心实验室完成。
材料:
实验动物:实验动物由郑州大学实验动物中心提供,许可证号SCXK(豫)2005-0001。选用清洁级雄性SD大鼠36只,进入实验时体质量180-220 g。笼养,每笼4只,动物于实验开始前1周,便饲养于昼夜节律12 h光照(7:00-19:00)12 h黑暗通风良好的河南省生物精神医学重点实验室动物房。环境温度控制在(22±2) ℃,动物能自由饮水和进食。
药品:盐酸吗啡注射液为东北制药集团公司沈阳第一制药厂生产,批号为100305-1。盐酸纳洛酮注射液为北京四环制药有限公司生产,批号为20100207。
实验装置:条件性位置反射训练箱:体积为60 cm× 30 cm×30 cm(长×宽×高),中间由可抽动隔板(30 cm× 30 cm)将其等分为两个小室。一侧:内侧各面均为黑色,底面光滑,简称为黑侧。另一侧:内侧各面均为白色,底面粗糙,简称为白侧。替代隔板(30 cm×30 cm):一侧底面有10 cm×10 cm的缺口,以便在试验鼠适应训练箱和测评位置厌恶时替代原来的隔板。实验鼠在两侧内的时间以及“可视性”的戒断症状均由自动录像系统自动记录。
实验方法:
实验分组:实验分为3组:慢性吗啡注射+纳洛酮催瘾组(吗啡+纳洛酮组);对照组:慢性吗啡注射+生理盐水“催瘾”组(吗啡+盐水组)和慢性生理盐水注射+纳洛酮催瘾组(盐水+纳洛酮组)。
各组处理:慢性吗啡注射:从第1天至第7天的上午(共计注射6 d半),2次/d(7:00;19:00),10 mg/(kg•次),腹腔注射。慢性生理盐水注射:按同期对照的原则,注射的均为生理盐水。纳洛酮催瘾注射:在慢性吗啡注射的第6天,0.3 mg/kg,腹腔注射1次。具体方法见参考文献[8]。
慢性吗啡成瘾纳洛酮催瘾戒断条件性位置厌恶建立:吗啡注射的同时进行条件性位置厌恶行为训练,大致可以分为3个阶段:条件化前阶段,条件化阶段和条件化后测试阶段,计算机控制的全自动监控系统记录。具体方法见参考文献[8]。
免疫组织化学标本的制备:每组大鼠分别于条件性位置厌恶建立前训练后、条件性位置厌恶测评后90 min,按每组6只随机选取,腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉,胸腹腔联合切开,暴露心脏,输液针头经左心室心尖部插管于升主动脉,并用血管嵌固定,剪开右心耳,先用无菌生理盐水200 mL快速灌注,直至流出液清亮,然后用40 g/L多聚甲醛250 mL以先快后慢的原则灌注固定30 min,断头取脑并将脑组织置于相同固定液中后固定24 h。参照大鼠脑部解剖图谱,将固定后的脑组冠状切面切取各含伏隔核壳区厚2.0-3.0 mm脑组织片,包埋,做成石蜡包块。PBS漂洗,室温下正常山羊血清封闭1 h并振荡,分别加一抗(Rabbit Polyclonal IgG多克隆抗体的工作液浓度1/150),4 ℃孵育过夜。PBS漂洗,分别加生物素化的二抗,2 h后PBS 漂洗、加ABC复合物,室温下反应2 h,PBS漂洗、DAB显色,显微镜下控制反应,显色满意后0.01 mol/L PBS充分漂洗终止反应。贴片,常规脱水透明、中性树胶封固。阴性对照是以正常山羊血清取代一抗,其余步骤不变。
免疫组织化学结果的观察与图像分析:石蜡切片经德国DM-2000 Leica Qwin V3图像采集与分析系统采集图片,免疫组织化学图片采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测定每张图片中腺苷酸环化酶Ⅷ阳性染色的平均吸光度,随机选取含有伏隔核壳区的切片5张,求其平均吸光度的平均值,并对其表达进行定量分析。
主要观察指标:①大鼠条件性位置厌恶建立结果。②大鼠戒断体征。③大鼠伏隔核壳区腺苷酸环化酶Ⅷ表达。
统计学分析:数据均使用SPSS 13.0统计软件包进行统计分析。计量资料以x±s表示。均数间的多重比较,采用方差分析,若存在差异,用Levene检验进行方差一致性检验,方差齐时,采用Least-significant difference (LSD)方法;若方差不齐时,用Tamhane’s T2方法。两均数之间的比较采用两独立样本的t 检验;率的比较采用确切概率法卡方检验。P < 0.05为差异有显著性意义。